Im Jahr 1522 übernahm Ottheinrich gemeinsam mit seinem Bruder Philipp die Regierung des neu geschaffenen Fürstentums Pfalz-Neuburg. Früh zeigte sich sein ausgeprägtes Interesse an den Künsten und Wissenschaften. Dies manifestierte sich in dem ambitionierten Ausbau seiner Residenz in Neuburg an der Donau zu einem prächtigen Renaissance-Schloss. Allerdings führten diese kostspieligen Bauvorhaben zu einer erheblichen Anhäufung von Schulden.
Ein prägendes Ereignis in jungen Jahren war Ottheinrichs Pilgerreise ins Heilige Land im Jahr 1521, bei der er zum Ritter vom Heiligen Grab geschlagen wurde.
Die Ideen der Reformation fanden in Ottheinrich einen frühen Anhänger. Er wandte sich dem evangelischen Glauben zu und führte 1542 in seinem Fürstentum die protestantische Konfession offiziell ein. Dieser Schritt zog Konflikte mit Kaiser Karl V. nach sich, der zeitweise die Reichsacht über ihn verhängte. Ottheinrich musste ins Exil gehen, zunächst nach Heidelberg und später nach Weinheim.
Am 16. Oktober 1529 heiratete Ottheinrich in Stettin Susanna von Bayern (1502–1543). Sie war die Tochter Herzog Albrechts IV. von Bayern und Kunigundes von Österreich, einer Enkelin Kaiser Friedrichs III. Die Ehe blieb kinderlos. Susanna teilte Ottheinrichs kulturelle Interessen und unterstützte seine Bauprojekte in Neuburg. Ihr früher Tod im Jahr 1543 hinterließ eine Lücke, die Ottheinrich nicht wieder füllte, da er keine zweite Ehe einging. Die Verbindung mit dem katholischen Bayern war in der Zeit der religiösen Spannungen politisch relevant, doch Ottheinrich blieb seinem protestantischen Glauben treu.
Nach dem Tod seines Onkels Friedrich II. im Jahr 1556 trat Ottheinrich das Amt des Kurfürsten von der Pfalz an. In seiner kurzen Regierungszeit setzte er die Reformation in der Kurpfalz endgültig durch und prägte das geistliche Leben des Territoriums nachhaltig. Sein bleibendes architektonisches Vermächtnis ist der nach ihm benannte Ottheinrichsbau am Heidelberger Schloss, ein Meisterwerk der deutschen Renaissance-Architektur. Darüber hinaus war er ein bedeutender Förderer der Bibliotheca Palatina, einer der angesehensten Büchersammlungen seiner Zeit, die Gelehrte aus ganz Europa anzog.
Ottheinrich verstarb am 12. Februar 1559 in Heidelberg. Mit seinem Tod endete die ältere Kurlinie der Pfalz. Sein ursprüngliches Grab in der Heiliggeistkirche in Heidelberg wurde im Pfälzischen Erbfolgekrieg zerstört. Sein Wirken als Förderer der Künste, Wissenschaften und der Reformation hinterließ jedoch nachhaltige Spuren in der Geschichte der Pfalz.